GD - Online C. Valenta: Neue Konservierungsstoffe
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Prof. Dr. Claudia Valenta

Entwicklung neuer Konservierungsstoffe auf Peptid- und Polypeptid-Basis

Institut für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie der Universität Wien

Die Konservierung topischer Arzneimittel (Salben, Cremes, Gele) kann in der Praxis zu Problemen wie z.B. erhöhtes Allergisierungsrisiko oder zu Unverträglichkeiten führen (1, 2). Um einen mikrobiellen Verderb zu verhindern, muss eine Zubereitung hygienisch einwandfrei hergestellt und bei Bedarf antimikrobiell behandelt werden. Der Zusatz eines geeigneten Konservierungsmittels (KM) soll eine mikrobielle Kontamination während der Verwendung ausschließen. In früheren Arbeiten wurde bereits darauf hingewiesen, dass durch das zusätzliche Verdünnen von an sich ausreichend konservierten Salbengrundlagen ihre mikrobielle Stabilität nicht mehr gewährleistet ist (3, 4) und daher in diesem Fall der Apotheker verpflichtet ist, das KM zu ergänzen. Ein KM für Dermatika sollte folgende Forderungen erfüllen (5): Es sollte ein breites Wirkungsspektrum haben, nicht toxisch, nicht irritierend, nicht allergisierend sein, einen guten Verteilungskoeffizienten besitzen, so dass eine ausreichend hohe Konzentration in der Wasserphase vorliegt, über einen breiten pH-Bereich stabil sein, mit den verschiedenen Komponenten des Präparates verträglich sein und die physischen Eigenschaften wie Aussehen, Geruch und Farbe nicht verändern. Kein KM besitzt alle diese Eigenschaften, daher muss für jedes Präparat ein geeignetes oder eine Kombination aus mehreren gefunden werden.

Da die Zahl der KM für Dermatika eingeschränkt ist (6) und es ein hohes Allergisierungsrisiko gibt, erscheint es sinnvoll, nach alternativen Konservantien zu suchen. Mikroorganismen produzieren eine Vielzahl von Verbindungen, um durch diese andere Mikroorganismen am Wachstum bzw. an ihrer Vermehrung zu hindern. Bei solchen Verbindungen handelt es sich nicht nur um niedermolekulare Strukturen wie Antibiotika, sondern auch um höhermolekulare Peptide und Proteine, die eine ausgezeichnete antibakterielle und/oder antifungale Wirkung aufweisen. Aus der Gruppe solcher antimikrobiell wirkender Peptide wurde das Lantibiotikum Nisin als mögliche Alternative zu bekannten KM auf sein Wirkungsspektrum und seine Stabilität in Dermatika getestet (7).

Jedoch wirken diese Peptide vorwiegend gegen grampositive Keime und nur eingeschränkt gegen gramnegative Bakterien, die aber den Hauptteil der abzutötenden Wasserbakterien darstellen. Eine Möglichkeit, das Wirkungsspektrum zu erweitern ist die Kombination mit Chelatbildnern. Es konnte z.B. gezeigt werden, dass das Wirkungsspektrum von Nisin in einem Chitosan-EDTA-Gel auch auf die weitaus problematischeren gramnegativen Keime ausgedehnt werden kann (8).

Bei der Auswahl von Peptiden für die Austestung als mögliche KM in topischen Zubereitungen sollen folgende Kriterien herangezogen werden: Geringe bis keine Toxizität, Mindestmolekularmasse von 3000 Da, um eine Hautresorption auszuschließen (9) und die Verfügbarkeit genügend großer Mengen des Reinpeptides. Aufgrund dieser Überlegungen wurde Lysozym ausgewählt. Lysozym, ein globuläres Peptid mit einer mittleren Molekularmasse von 14 400 Da, ist gut gegen grampositive Keime wirksam. Die Wirkung beruht auf einer Spaltung der ß-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetyl-D-glucosaminresten in Peptidoglykanen wie z.B. dem Murein. Dadurch kommt es zur Bakteriolyse durch direkten Angriff auf die Zellwand grampositiver Bakterien. Lysozym wird bereits oral und i.v. gegen bakterielle Infektionen eingesetzt. Topisch wird es gegen Herpes simplex und Herpes zoster angewendet (10).

Das gegen grampositive Bakterien wirkende Lysozym wurde nun mit Verbindungen, wie Zimtaldehyd, Kaffee- oder Zimtsäure, die auch gegen gramnegative Bakterien wirksam sind, kovalent gekoppelt.
In einer erstern Versuchsanordnung wurde eine reduktive Kopplung (11) von Zimtaldehyd an die freien Aminogruppen der Lysinreste des Lysozyms vorgenommen; durch diese Modifikation wurde zwar das Wirkungsspektrum erweitert, bei der Austestung in dermalen Formulierungen als mögliche neue Konservantien konnte eine Keimzahlverminderung jedoch nicht im geforderten Ausmaß der Pharmakopoe erreicht werden (12).
Als zweite Reaktion wurde die kovalente Kopplung von Kaffeesäure bzw. Zimtsäure an Lysozym durch Ausbildung von Amidbindungen zwischen der Carboxylgruppe des Liganden und einer primären Aminogruppe am Lysozym durch eine von Carbodiimid vermittelte Reaktion durchgeführt. Es entstanden neue kovalent gebundene Kaffee- bzw. Zimtsäure/Lysozymkonjugate (13).
Die Austestung des antimikrobiellen Spektrums wurde für alle Konjugate mit Staphylococcus aureus (ATCC 6538) als Modellkeim für grampositiv und mit Escherichia coli (ATCC 8739) als Modellkeim für gramnegativ durchgeführt. Während bei den Lysozym/Kaffeesäure Konjugaten zwar die Wirkung auf gramnegative Keime verstärkt werden konnte, kam es zu einer Wirkverminderung gegen grampositive Keime. Die Lysozym/Zimtsäurekonjugate zeigten keine signifikante Erweiterung des antimikrobiellen Spektrums.
Um den Verlust der Wirkung gegen grampositive Keime der Kaffesäurekonjugate wieder auszugleichen, erschien es sinnvoll, eine Mischung von Lysozym/Kaffeesäurekonjugat mit Lysozym (1+1) auf ihre antimikrobielle Wirkung auszutesten. Diese Mischung wurde in 3 verschiedenen dermal angewendeten Hydrogelen auf ihre ausreichende Konservierung gestestet. In HPMC und Natrium-Chitosan-EDTA-Gelen war eine ausreichende Konservierung gegeben. Nur in Carbopol-Gelen war diese aufgrund von adsorptiver Bindung an das Polymersystem behindert (14).

Abschließend kann festgestellt werden, dass es sich bei Lysozym-Kaffeesäurekonjugaten um interessante neue Konservantien handelt, deren Penetration durch die Haut aufgrund ihrer hohen Molekülmasse nahezu auszuschließen ist. Ihre Wirkung hängt jedoch auch vom Vehikel ab, in dem sie eingesetzt werden. Die antimikrobielle Wirkung sollte daher immer überprüft werden, da eine Wirkverminderung aufgrund von adsorptiver Bindung an Vehikelbestandteile nicht auszuschließen ist. Durch neue biotechnologische Methoden werden immer mehr antimikrobielle Peptide in ausreichendem Ausmaß zur Verfügung stehen und daher wird ein Einsatz von KM auf Basis von Peptiden/Polypeptiden immer interessanter werden.

Literatur:
(1) Van Doorne H.: Preservation of ointments and creams. Deutsche Apotheker Zeitung 125, 800, 1985
(2) Wallhäußer K.H.: Praxis der Sterilisation Desinfektion-Konservierung 4.Ed.,p. 319, Thieme Verlag, Stuttgart 1984
(3) Bernkop-Schnürch A., Valenta C., Urban U.: Mikrobielle Stabilität von magistral hergestellten Dermatika. Sci.Pharm. 63, 65, 1995
(4) Bernkop-Schnürch A. und Valenta C.: Untersuchungen zur mikrobiellen Stabilität von magistral hergestellten Cremen und Gelen. ÖAZ 49, 926, 1995
(5) Croshaw B.: Preservatives for cosmetics and toiletries. J.Soc.Cosmet Chemists 28, 3, 1977
(6) Van Ooteghem M.: Gebrauch von Konservierungsmitteln in Dermatica. Pharmazie 39, 621, 1984
(7) Valenta C., Bernkop-Schnürch A. und Teltscher Ch.: Nisin, ein potentielles Konservierungsmittel in topischen Zubereitungen. Pharmazie 51, 119, 1996
(8) Valenta C.; Christen B., Bernkop-Schnürch A.: Chitosan-EDTA Conjugate: A Novel Polymer for Topical used Gels. J.Pharm.Pharmacol. 50, 1-8, 1998
(9) Bernkop-Schnürch A., Valenta C., Gatterwe V.: In vitro-skin permeation of the lantibiotic nisin. Eur.J.Pharm.Biopharm. 42, 336, 1996
(10) Morant J., Ruppaner H., (Ed): Arzneimittelkompendium Schweiz, Documed Basel 1995
(11) Means, G.E., Feeny, R. E.: Reductive Alkylation of Proteins. Analytical Biochemistry. 224, 1-16, 1995
(12) Valenta C., Bernkop-Schnürch A., Schwartz M.: Modification of lysozyme with cinnamaldehyde: A strategy for constructing novel preservatives for dermatics. Int.J.Pharm. 148, 131-137, 1997
(13) Bernkop-Schnürch A., Krist S., Vehabovic M., Valenta C.: Synthesis and Evaluation of lysozyme derivatives exhibiting an enhanced antimicrobial action. Eur.J.Pharm.Sci. 6, 301-306, 1998
(14) Valenta C., Schwarz E., Bernkop-Schnürch A.: Lysozyme-Caffeic acid conjugates: Possible novel preservatives for dermal formulations. Int.J.Pharm. 174, 125-132, 1998

Prof. Dr. Claudia Valenta


Foto: Gesellschaft für Dermopharmazie

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